结核分枝杆菌俗称结核杆菌，是引起结核病的病原体，1882年由德国细菌学家郭霍发现并证明为人类结核病的病原菌，该菌可侵犯全身各器官但以引起肺结核最多见。结核病是全球及我国严重的公共卫生问题，耐多药结核病和广泛耐药结核病是目前临床亟待解决的难题之一。因此，快速、准确地检测标本中耐药结核分枝杆菌，快速诊断耐药结核病，对有效控制结核病疫情是至关重要的。
现代抗生素的广泛使用丰富了环境中微生物的耐药性机制，致使抗生素耐药性基因相继出现并迅速传播，时至今日，抗生素耐药生物已成为全球公共卫生关注的一个重要问题，世界卫生组织将抗生素耐药性描述为当今传染病面临的最大挑战，无论是国内生产总值高还是低的国家都面临同样的威胁。因此为了对抗全球抗生素耐药性的威胁，快速确定耐药微生物和抗生素耐药基因的特征、监控它们在空间和时间上的分布、识别新的耐药微生物和抗性途径显得格外重要。
结核分歧杆菌耐药基因检测 免疫反应检测 |
结核分枝杆菌简称为结核杆菌，是人类结核病的病原体，是专性需氧的一类细菌，抗酸染色阳性。无鞭毛，有菌毛，有微荚膜但不形成芽孢，其细菌壁既没有革兰阳性菌的磷壁酸，也没有革兰阴性菌的脂多糖。德国细菌学家郭霍于1882年发现并证明为人类结核病的病原菌，该菌感染人体导致的结核病是严重影响人类生命健康的一种传染病，经过与其几个世纪的抗争后逐渐得到控制，但近年来由于多种因素的影响，该疾病变得日趋严重。
根据世界卫生组织报道，结核病耐药情况十分严重，2016年全球新发结核病患者1040万，130万人死于结核病；60万新发结核病患者耐利福平，其中49万是耐多药结核病患者，耐药结核病尤其是耐多药结核病、广泛耐药结核病的快速诊断和有效治疗是当前结核病防控中亟需解决的难题。
我国结核病患者中，利福平耐药90%～95%是由于rpoB突变所致，其中531位、526位和513位密码子突变通常导致大多数结核菌对利福平、利福喷丁高水平耐药，而对利福布丁高水平和低水平的耐药各占一半；514和533位密码子突变一般导致低水平耐药；508位和509位氨基酸置换已证实与耐利福平无关。利福平分子药敏检测结果与表型药敏试验结果具有较好的一致性，利福平与利福喷丁和利福布丁有70-90%的交叉耐药率。因此，利福平耐药一般不主张更换为利福喷丁，是否更换为利福布丁需根据表型药敏结果确定，耐药结核病通常采用二线抗结核药物治疗。
我国结核病患者中，异烟肼耐药70%～80%是由于katG315位密码子突变所致，应认识到该突变只是导致katG酶活性降低，但仍能催化异烟肼转换为其活性型异烟酸而发挥抗结核作用，只是转换效率降低，表型药敏试验通常表现为结核菌对异烟肼低水平耐受或敏感，建议临床上加大异烟肼剂量或加用对氨水杨酸或更换为对氨水杨酸-异烟肼或丙硫异烟胺或乙硫异烟胺。10%左右患者M结核病 katG完全缺失，一般会导致高水平耐异烟肼，继续应用异烟肼治疗效果不理想，建议更换为丙硫异烟胺或乙硫异烟胺。10％左右患者结核菌菌株异烟肼A-15位核苷酸突变，表型药敏试验通常表现为结核菌对异烟肼、丙硫异烟胺、乙硫异烟胺低、中或高水平耐受或敏感。因此，异烟肼A-15位突变会导致异烟肼与丙硫异烟胺、乙硫异烟胺有一定的交叉耐药性。
1. 利福霉素类药物：利福平、利福喷丁和利福布丁均为一线抗结核药物，其作用靶标RNA聚合酶α、β、β'亚单位编码基因rpoA、rpoB、rpoC突变均可能导致Mtb对其耐受。其中95%左右的突变发生在rpoB507至533位氨基酸密码子，最常见的突变位点是531位和526位氨基酸密码子；
2. 异烟肼及异烟酸衍生物：结核菌耐异烟肼主要与过氧化氢酶-过氧化物酶编码基因缺失或突变以及烯酰基运载蛋白还原酶的调控基因突变有关；KatG315位密码子和inhA-15位是最常见突变位点。而异烟酸衍生物丙硫异烟胺和乙硫异烟胺耐药主要是由于参与分枝菌酸合成的inhA编码基因和启动子区域及其激活剂单氧酶编码基因ethA突变所致；
3. 乙胺丁醇：结核菌耐乙胺丁醇与阿拉伯糖基转移酶编码基因embA、embB和embC表达增高或突变有关，其中embB306位密码子是最常见突变位点；
4. 吡嗪酰胺：结核菌耐吡嗪酰胺主要是由于吡嗪酰胺酶编码基因pncA、核糖体蛋白S1编码基因rpsA和天冬氨酸脱羧酶基因panD突变所致，其中pncA编码基因突变是最常见原因，相对热点区域位于3～17、61～85和132～142位密码子。但应注意的是，部分pncA突变与耐药无关；
5. 链霉素及结核菌耐链霉素是由于其核糖体蛋白S12编码基因rpsL和16S rRNA编码基因rrs突变所致，RpsL43位和88位密码子及rrs905位和513位核苷酸是最常见的突变位点；
6. 结核菌耐喹诺酮类药物主要是其DNA旋转酶的A亚单位编码基因gyrA或B亚单位编码基因gyrB突变所致，其中gyrA67～106位密码子是结核菌喹诺酮耐药决定区；
7. 卡那霉素、氨基羟丁基卡那霉素A、卷曲霉素和紫霉素：结核菌耐卡那霉素、氨基羟丁基卡那霉素A、卷曲霉素和紫霉素主要与rrs基因突变有关，其中A1401G置换是最常见的突变；
8. 贝达喹啉和氯法齐明：Rv0678和pepQ基因突变均会导致结核菌对贝达喹啉和氯法齐明低水平的耐受，使两者产生交叉耐药性；
9. PA-824和德拉马尼：结核菌耐受PA-824和德拉马尼主要是由于F 420依赖的生物激活途径中的下列5个基因突变所致：硝基还原酶基因ddn、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因fgd1、2-磷酸-L-乳酸转移酶基因fbiA、fbiB和7,8-二脱甲基-8-羟基-5'脱氮核黄素-5'-磷酸盐合成酶基因fbiC；
10. 结核菌耐大环内脂类药物可能与其存在单甲基化转移酶ermMT和膜外排泵编码基因Tap有关，使其对该类药物呈天然抗性；
11. 环丝氨酸：结核菌耐环丝氨酸可能与谷氨酸脱羧酶编码基因gadA、D-丙氨酸消旋酶编码基因alrA、D-丙氨酸连接酶编码基因ddlA和L-丙氨酸脱氢酶编码基因ald突变有关。
目前主要采用下列两种方法：表型药敏方法和分子药敏方法。
表型药敏方法是建立在培养基础上的，通过观察结核菌在含药培养基中的生长情况来检测其耐药性,是目前耐药检测的金标准。由于结核菌慢生长的特性决定了该方法需较长时间，但其可检测较多种类药物的耐药性。
分子药敏方法是采用分子生物学技术检测、鉴定结核菌的耐药基因突变型。分子检测的优点是可快速、灵敏地从临床标本中检出耐药结核菌，甚至涂阴、培阴的标本，但检测的药物种类有限。目前任何单一的药物敏感性检测方法并不能完全满足临床需求，通常可检测十几种药物的表型药敏方法与快速检测部分药物耐药基因型的分子药敏方法相结合，优势互补，为临床快速诊断和有效治疗耐药TB提供实验依据。
分子生物学技术检测意义：
1. 可快速定性检测结核杆菌感染情况，为治疗争取时间，减少新的耐药菌产生。结核杆菌因其培养周期长，临床很难采用培养方法进行结核杆菌感染的快速诊断，而采用基因芯片法，则可以做到这一点，如通过对痰、血液、淋巴液、脑脊液、胸腔积液、腹水等标本中结核杆菌的基因芯片检测，可快速诊断肺结核、结核杆菌菌血症、淋巴结合、结核性脑膜炎、结核性胸腹膜炎等；
2. 一次检测辅助多种药物选择，降低患者用药负担；
3. 能尽早确定病原体的耐药特性，对控制疾病发展、提高治愈率有潜在的价值；
4. 有助于抗结核治疗的监测，在抗结核治疗中，采用基因芯片方法定期检测，可评价抗结核药物的疗效；
5. 要注意临床“假阳性”问题，基因芯片检测的是病原体核酸，不管结核杆菌是否为活细菌，基因芯片均能检出，在经抗生素治疗一个疗程后，建议两周后再做基因芯片检测，以避免临床假阳性。
我国是结核病高发国家之一，每年新增结核病患者约150万，因此结核病是我国重点控制的重大疾病之一。结核病的爆发将会给中国的公共卫生安全带来极大的威胁，在结核病防治中，如何快速准确地诊断结合是社会面临的最大难题之一。
结核病诊断和辅助诊断方法现状：
1. 影像学方法：特异性较差，与医师的经验有关，主观性强；
2. 体外培养：结核病诊断金标准，敏感性为30-50%且耗时2-8周；
3. 抗酸染色法（涂片法）：敏感性为30-40%；
4. 血清结合抗体定性检测：敏感性在0-100，特异性约为47-100%；
5. 分子诊断方法：重复性较差，样本前处理要求高；
6. 结核菌素试验：受卡介苗干扰，特异性差，在肺结核病人中存在10-25%的假阴性。
传统的结核分枝杆菌检测方法众多，包括结核菌素皮试、涂片、镜检、分枝杆菌培养、组织病理、结核抗体检测、结核PCR检测等，但受限于假阳性、假阴性率高，敏感性低，无法区分结核或非结核分枝杆菌，操作繁琐，实验室要求高等缺点，临床需求仍得不到真正满足。随着基因工程的不断发展，有力地推动了临床检验从宏观扩展到微观领域，从细胞水平深入到分子水平。研究人员发现效应T细胞被近期暴露的抗原在体外再次刺激后会释放γ-干扰素，基于这一研究发现，T-SPOT.TB 检测利用结核特异抗原ESAT-6及CFP-10，通过酶联免疫斑点技术(ELISPOT)检测受试者体内是否存在结核效应T淋巴细胞，从而判断目前该受试者是否感染结核杆菌（现症感染）。
技术背景：
1. γ-干扰素释放实验；
2. 酶联免疫技术；
3. 结核杆菌特异抗原。
检验原理：
机体感染结核杆菌后，血液中的记忆性淋巴细胞会在再次接触结核杆菌特异性抗原时，产生γ-干扰素。应用基因工程技术将相应蛋白修饰后表达为结核杆菌特异性抗原，刺激全血，血液中会产生特异性γ-干扰素，采用酶联免疫法检测γ-干扰素，可据此判断机体是否存在针对结核杆菌特异性的细胞免疫反应。
目前常用于临床诊断的方法及时、有效地对结核病进行诊断，近年来γ干扰素释放试验分析技术（IGRA）被用于结核病的诊断，已有研究显示出了良好的应用前景。其中有两种比较成熟的γ干扰素释放试验方法，及酶联免疫吸附法和酶联免疫斑点法，而结核杆菌特异型细胞免疫反应检测主要使用酶联免疫法。
近年来IGRA被用于结核病的诊断成为热点，是一种用于结核杆菌感染的体外免疫检测的新方法。现有研究表明，IGRA不受卡介苗接种和非结核分歧杆菌感染的影响，在活动性结核病和潜伏感染中的诊断价值较高，美国CDC指南建议在当前应用结核菌素试验PPD的所有情况下均可使用IGRA所代替。
IGRA技术目前有2种，包括基于全血细胞培养的ELISA和基于外周血淋巴细胞培养的ELISPOT。已有研究表明，两者诊断性能相似，均显示出了良好的应用前景，国内多个研究集中在ELISPOT检测技术上，对ELISA检测技术方法的研究报道极少，且IGRA技术在基层医院几乎没有开展。
产品优势特点：
1. 高灵敏度：结核感染引起细胞免疫反应早于细胞学和影像学表现；
2. 高特异性：不受卡介苗和绝大多数非结核分歧杆菌影响；
3. 安全快速：次日可出报告；
4. 无需带菌标本：适用于“菌阴肺结核”及“肺外结核”的鉴别；
5. 受个体免疫功能低下影响小。
样本要求：
1. 新鲜采集的肝素钠抗凝全血；
2. 每份样本不得少于3mL；
3. 样本常温保存，不得冷冻或冷藏；
4. 样本采集后16小时内进行前处理。
交叉反应性：
以IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、GM-CSF等9种细胞因子作为干扰物在反应体系中的浓度与γ-干扰素的浓度相当或为γ-干扰素浓度的2-4倍时，无明显交叉反应。
干扰样本对检测的影响：
1. 溶血：游离血红蛋白浓度达156.6-683.9μg/ml时，对检测结果未见显著影响；
2. 脂血：甘油三酯水平最高达9.35mmol/L对检测结果没有显著影响；
3. 类风湿：类风湿因子11.3-79.6U/ml，C反应蛋白为96.3-245.9 mg/L时，对测结果没有显著影响；
4. 免疫抑制剂;肾上腺皮质激素类免疫抑制剂对测结果没有影响，大环内酯类免疫抑制剂FK506患者的样本不适合此种检测方法。
结核杆菌特异性细胞免疫反应检测在结核病临床辅助诊断中的应用价值显著高于结核菌特异性抗体检测，对结核病具有重要的辅助诊断价值，尤其适用于我国卡介苗接种人群。对菌阴结核病、肺外结核和HIV/结核联合感染、糖尿病合并结核病患者、以及结核病公共突发事件具有重要应用价值，且对操作者的技能和实验室设备的要求也比较低，适宜在基层医院开展。
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